5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix pluss-UNG
Kat.nr.: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) er en svært stabil ett-rørs probebasert blanding egnet for ett-trinns revers transkripsjon og kvantitativ PCR (qRT-PCR).Den støtter forblanding av primere og prober og holder seg stabil etter lang tids lagring ved lav temperatur.Prøven som skal testes kan tilsettes direkte ved bruk, uten ytterligere røråpning/pipetteringsoperasjon.Dette produktet gir komponenter, f.eks. hot-start DNA polymerase, M-MLV, varmelabil uracil DNA glykosylase (TS-UNG), RNase Inhibitor, MgCl2, dNTP-er (med dUTP i stedet for dTTP) og stabilisatorer.Med den genmodifiserte raske amplifikasjonen revers transkriptase og DNA-polymerase er det mulig å fullføre PCR-amplifikasjonen innen 20-40 minutter.Denne reagensen bruker spesiell buffer for qPCR med blandede enzymer av anti-inhiberende amplifikasjonsenzym og UNG-enzym.Derfor kan den oppnå god amplifisering av målgener og forhindre falsk amplifikasjon forårsaket av PCR-rest- og aerosolforurensning.Denne reagensen er kompatibel med de fleste fluorescens kvantitative PCR-instrumenter fra produsenter som Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad og Roche.
Komponent
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG-miks
2.5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Lagringsforhold
Alle komponenter bør oppbevares ved -20 ℃ for langtidslagring og 4 ℃ i opptil 3 måneder.Vennligst bland grundig etter tining og sentrifuger før bruk.Unngå hyppig frysing-tining.
Forberedelse av qRT-PCR-reaksjonssystem
| Komponenter | 25μLSystem | 50μLSystem | Endelig konsentrasjon |
| 5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5 μL | 10 μL | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG-miks | 1μL | 2μL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mixa | 1μL | 2μL | 1× |
| Mal RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Opptil 25μL | Opptil 50μL | – |
1) a. Sluttkonsentrasjonen av primer er vanligvis 0,2μM.For bedre resultater kan primerkonsentrasjonen optimaliseres innenfor området 0,2-1μM.Vanligvis kan probekonsentrasjonen optimaliseres innenfor området 0,1-0,3μM.
2) b. Når du bruker en rask PCR-prosedyre, kan økning av konsentrasjonen av primere og prober resultere i bedre amplifikasjonsresultater, og forholdet mellom dem bør optimaliseres tilsvarende.
3) Ulike typer prøver inneholder ulike typer og innhold av inhibitor og kopinummer av målgen.Prøvevolumet bør vurderes etter faktisk tilstand.Lag en fortynning av prøven med nukleasefritt vann eller TE-buffer, om nødvendig.
Reaksjon Cbetingelser
| Vanlig PCR-prosedyre | Rask PCR-prosedyre | ||||||
| Fremgangsmåte | Temp. | Tid | Syklus | Fremgangsmåte | Temp. | Tid | Syklus |
| Omvendt transkripsjon | 50 ℃ | 10-20 minutter | 1 | Omvendt transkripsjon | 50 ℃ | 5 minutter | 1 |
| Polymerase Aktivering | 95 ℃ | 1-5 minutter | 1 | Polymerase Aktivering | 95 ℃ | 30-årene | 1 |
| Denaturering | 95 ℃ | 10-20 s | 40-50 | Denaturering | 95 ℃ | 1-3 s | 40-50 |
| Gløding og Utvidelse | 56–64 ℃ | 20-60-tallet | Gløding og Utvidelse | 56–64 ℃ | 3-20 s | ||
Kvalitetskontroll
1.Funksjonsdeteksjon: sensitivitet, spesifisitet og repeterbarhet av qPCR.
2.Ingen eksogen nukleaseaktivitet: ingen eksogen endonuklease og eksonukleaseforurensning.
Notater
1.Amplifikasjonshastigheten for hurtig DNA-polymerase er ikke mindre enn 1kb/10s.Ulike PCR-instrumenter har forskjellige oppvarmings- og kjølehastigheter, temperaturkontrollmoduser og termisk ledningsevne, og derfor er optimalisering av primer/probe-konsentrasjonen og kjøremetoden i kombinasjon med ditt spesifikke raske PCR-instrument avgjørende.
2.Dette produktet har bred anvendelighet, og det er egnet for høysensitiv molekylær diagnose.Tre-trinns PCR-metode anbefales for primere med lav annealingstemperatur eller for amplifikasjon av lange fragmenter over 200 bp.
3.Siden forskjellige amplikoner har forskjellig utnyttelseseffektivitet av dUTP og forskjellig følsomhet for UNG, bør reagensene optimaliseres hvis deteksjonssensitiviteten reduseres ved bruk av UNG-system.Ta kontakt med oss for teknisk støtte ved behov.
4.For å unngå amplifisering av overførte PCR-produkter, kreves dedikert forsøksområde og pipette for amplifikasjon.Bruk hansker og bytt ofte og ikke åpne PCR-røret etter amplifikasjon.
