Dobbelttrådet RNA (dsRNA) ELISA KIT

Dette settet er en Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)-kobling med biotin-Streptavidin-system, for kvantitativ måling av dsRNA med lengde over 60 basepar (bp), uavhengig av sekvensen.Platen er forhåndsbelagt med anti-dsRNA-antistoff.dsRNA som er tilstede i prøven tilsettes og binder seg til antistoffer belagt på brønnene.Og så tilsettes biotinylert anti-dsRNA-antistoff og binder seg til dsRNA i prøven.Etter vasking tilsettes HRP-Streptavidin og binder seg til det biotinylerte anti-dsRNA-antistoffet.Etter inkubering vaskes ubundet HRP-Streptavidin bort.Deretter tilsettes TMB-substratløsning og katalyseres av HRP for å produsere et blått fargeprodukt som endret seg til gult etter tilsetning av sur stoppløsning.Tettheten av gult er proporsjonal med målmengden av dsRNA fanget i platen.Absorbansen måles ved 450 nm.

applikasjon

Dette settet er for kvantitativ måling av gjenværende dsRNA.

Komponenter i sett

Lagring og stabilitet

1. For ubrukt sett: Hele settet kan lagres ved 2~8 ℃ i holdbarhet.Sterkt lys bør unngås for lagringsstabilitet.

2. For brukt sett: Når mikroplaten er åpnet, dekk til ubrukte brønner med plateforsegler og returner til folieposen som inneholder tørkemiddelpakken, forsegl folieposen med glidelås og returner til 2~8 ℃ så snart som mulig etter bruk.Andre reagenser bør returneres til 2~8℃ så snart som mulig etter bruk.

Materialer som kreves, men ikke levert

1. Mikroplateleser med 450±10nm filter (bedre hvis den kan oppdage ved 450 og 650 nm bølgelengde).

2. Mikroplaterister.

3. RNase-frie spisser og sentrifugerør.

Driftsflytskjema

Før du begynner

1. Ta med alle settkomponenter og prøver til romtemperatur (18-25 ℃) før bruk.Hvis settet ikke skal brukes opp på én gang, må du bare ta ut strimler og reagenser for det nåværende eksperimentet, og la de resterende strimlene og reagensene være i nødvendig tilstand.

2. Vaskebuffer: Fortynn 40mL 20x konsentrert vaskebuffer med 760mL avionisert eller destillert vann for å tilberede 800mL 1x vaskebuffer.

3. Standard: sentrifuger eller sentrifuger stamløsningen kort før bruk.Konsentrasjonen av fire standarder er 5ng/μL.For UTP- og pUTP-dsRNA-standarder, fortynn stamløsningen til 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL med STE-buffer for å tegne standardkurven.For N1-Me-pUTP dsRNA-standarder, fortynn stamløsningen til 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL med STE-buffer for å tegne standardkurven.For 5-OMe-UTP dsRNA-standard, fortynn stamløsningen til 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0pg/μL med STE-buffer for å tegne standardkurven.Vi anbefaler at standarder kan fortynnes som følgende diagrammer:

4. Biotinylert deteksjonsantistoff og HRP-streptavidin arbeidsløsning: spinn eller sentrifuger stamløsningen kort før bruk.Fortynn dem til arbeidskonsentrasjonen med fortynningsbuffer.

5. TMB-substate: aspirer den nødvendige dosen av løsningen med steriliserte spisser og ikke tøm den gjenværende løsningen i hetteglasset igjen.TMB-substaten er følsom for lys, ikke utsett TMB-substratet for lys over lang tid.

Bruker protokoll

1. Bestem antall strimler som kreves for analysen.Sett inn stripene i rammene for bruk.Resterende platestrimler som ikke brukes i denne analysen, skal pakkes på nytt i posen med tørkemiddel.Lukk posen godt for oppbevaring i kjøleskap.

2. Tilsett 100 μL hver av fortynningene av standard, blindprøve og prøver i de riktige brønnene.Dekk til med plateforsegleren.Inkuber i 1 time ved romtemperatur med risting ved 500 rpm.Prøvene bør fortynnes med STE-buffer til passende konsentrasjon for nøyaktig analyse.

3. Vasketrinn: Aspirer løsningen og vask med 250μL vaskebuffer til hver brønn og la den stå i 30 sekunder.Kast vaskebuffer helt ved å klikke platen på absorberende papir.Vaskes totalt 4 ganger.

4. Tilsett 100 μL arbeidsløsning for biotinylert deteksjonsantistoff i hver brønn.Dekk til med plateforsegleren.Inkuber i 1 time ved romtemperatur med risting ved 500 rpm.

5. Gjenta vasketrinn.

6. Tilsett 100 μL HRP-streptavidin arbeidsløsning i hver brønn.Dekk til med plateforsegleren.Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur med risting ved 500 rpm.

7. Gjenta vasketrinnet igjen.

8. Tilsett 100 μL TMB-substratløsning i hver brønn.Dekk til med plateforsegleren.Inkuber i 30 minutter ved RT Beskytt mot lys.Væsken blir blå ved tilsetning av substratløsning.

9. Tilsett 50 μL stoppløsning i hver brønn.Væsken blir gul ved tilsetning av stoppløsning.Kjør deretter mikroplateleseren og utfør måling ved 450nm umiddelbart.

Beregning av resultater

1. Ta et gjennomsnitt av duplikatavlesningene for hver standard, kontroll og prøver og trekk fra gjennomsnittlig null standard optisk tetthet.Konstruer en standardkurve med absorbans på den vertikale(Y)-aksen og dsRNA-konsentrasjon på den horisontale(X）-aksen.

2. Det anbefales å utføre beregningen med datamaskinbasert kurvetilpasningsprogramvare som kurveekspert 1.3 eller ELISA Calc i en 5 eller 4 parameters ikke-lineær tilpasningsmodell.

Opptreden

1. Følsomhet:

nedre deteksjonsgrense: ≤ 0,001 pg/μL (for UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (for 5-OMe-UTP-dsRNA).

nedre grense for kvantifisering: 0,0156 pg/μL (for UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (for N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (for 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Presisjon: CV for Intra-analyse ≤10 %, CV for Inter-Assay ≤10 %

3. Gjenoppretting: 80%~120%

4.Linearitet:0,0156-0,5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0,0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA),0,0625-1pg/μL(for 5-OMe-UTP-dsRNA).

Betraktninger

1. TMB reaksjonstemperatur og tid er kritisk, vennligst kontroller dem i henhold til instruksjonene strengt.

2. For å oppnå god analysereproduserbarhet og sensitivitet, er riktig vask av platene for å fjerne overflødig u-reagerte reagenser avgjørende.

3. Alle reagensene skal blandes grundig før bruk og unngå bumbles under tilsetning av prøve eller reagens.

4. Hvis det er dannet krystaller i den konsentrerte vaskebufferen (20x), varm opp til 37 ℃ og bland forsiktig til krystallene er fullstendig oppløst.

5. Unngå analyse av prøver som inneholder natriumazid (NaN3), da det kan ødelegge HRP-aktiviteten og resultere i undervurdering av mengden dsRNA.

6. Unngå RNase-kontaminering under analysen.

7. Standarden/prøven, deteksjonsantistoffet og SA-HRP kan også utføres ved RT uten risting, men dette kan føre til at deteksjonsfølsomheten reduseres med en gang.For dette tilfellet anbefaler vi at UTP- og pUTP dsRNA-standarder fortynnes fra 2pg/μL, N1-Me-pUTP dsRNA-standarder bør fortynnes fra 4pg/μL og 5-OMe-UTP dsRNA-standarder bør fortynnes fra 8pg/μL.I tillegg inkuber HRP-streptavidin arbeidsløsning i 60 minutter ved romtemperatur.Ikke bruk flaskerister, fordi flaskerister kan føre til unøyaktig resultat.

Typisk resultat

1. Standard kurvedata

2. Standard kurveberegning

3. Liner-deteksjonsområde: 0,0312- 1pg/μL