M-MLV omvendt transkriptase
RevScript Revers transkriptase oppnås ved hjelp av genteknologi.Den har høyere cDNA-synteseevne, termisk stabilitet og reaksjonstemperaturgrense (opptil 60°C).Det syntetiserte cDNA-produktet er opptil 10 kb.Det forbedrer affiniteten til malene og er egnet for revers transkripsjon av RNA-maler med kompleks sekundær struktur eller gener med lav kopi.
Komponenter
| Komponent | HC2003B (10 000 U) | HC2003B (5*10 000 U) | HC2003B (200 000 U) |
| RevScript omvendt transkriptase (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 ml |
| 5 × RevScript-buffer | 250 μL | 1,25 ml | 5 ml |
Lagringsforhold
Dette produktet bør oppbevares ved -25°C~-15°C i 2 år.
Enhetsdefinisjon
En enhet inkorporerer 1 nmol dTTP i syreuløselig materiale i løpet av 10 minutter ved 37°C ved bruk av Oligo(dT) som primere.
Reaksjonsoppsett
1.Denaturering av RNA-template (Dette trinnet er valgfritt, denaturering av RNA-template bidrar til å åpne de sekundære strukturene, noe som vil forbedre utbyttet av den første strengen cDNA.)
| Komponenter | Volum (μL) |
| RNase fri ddH2O | Til 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) eller Random Primer (50 μmol/L) Eller genspesifikke primere (2 μmol/L) | 1 |
| eller 1 | |
| eller 1 | |
| RNA-mal | X a |
Merknader:
1) a: Total RNA: 1-5 ug eller mRNA: 1-500 ng
2) Inkuber ved 65°C i 5 minutter, og overfør deretter på is umiddelbart for å avkjøles i 2 minutter.Kort sentrifugering for å samle opp reaksjonsvæske, tilsett reaksjonsløsningen for revers transkripsjon som vist i følgende tabell.Pipetter forsiktig for å blande.
1.Forberedelse av reaksjonsblandingen (20 μL volum)
| Komponenter | Volum (μL) |
| Blanding av forrige trinn | 13 |
| 5×buffer | 4 |
| dNTP-blanding (10nmol/L) | 1 |
| Revers transkriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase-hemmer (40 U/μL) | 1 |
1.Utfør reaksjonen under følgende forhold:
| Temperatur (°C) | Tid |
| 25 °Ca | 5 minutter |
| 42 °Cb | 15-30 minutter |
| 85 °Cc | 5 minutter |
Merknader:
1) a.Inkubering ved 25 °C i 5 minutter er kun nødvendig for bruk av tilfeldige heksamere.Vennligst hopp over dette trinnet når du bruker Oligo (dT)18eller genspesifikk primer.
2) b.Anbefalt revers transkripsjonstemperatur er 42°C. For maler med kompliserte sekundære strukturer eller høyt GC-innhold anbefales det å heve reaksjonstemperaturen til 50-55°C.
3) c.Oppvarming ved 85 °C i 5 minutter for å inaktivere revers transkriptase.
4) Produktet kan brukes direkte i PCR- eller qPCR-reaksjoner, eller lagres ved -20°C for korttidslagring.Det anbefales å justere produktene og lagre ved -80°C for langtidslagring.Unngå hyppig frysing-tining.
5) Produktet er egnet for ett-trinns RT-qPCR, det anbefales å legge til 10-20 U revers transkriptase for hvert 25μL reaksjonssystem, eller gradvis øke mengden av revers transkriptase i henhold til den faktiske situasjonen.
Notater
1.Vennligst hold forsøksområdet rent;Rene hansker og masker skal brukes under drift.Alle forbruksvarer som brukes i eksperimentet bør være RNase-frie for å forhindre RNase-kontaminering.
2.Alle prosedyrer bør utføres på is for å forhindre RNA-nedbrytning.
3.RNA-prøver av høy kvalitet anbefales for å sikre høy effektivitet av revers transkripsjon.
4.Dette produktet er kun for forskningsbruk.
5.Bruk laboratoriefrakker og engangshansker for din sikkerhet.
