mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2´-O-metyltransferase ble avledet fra en rekombinant E. coli-stamme som bærer genet for vaccinia mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase.Dette enzymet legger til en metylgruppe i 2´-O-posisjonen til det første nukleotidet ved siden av cap-strukturen ved 5´-enden av RNA. Enzymet bruker S-adenosylmetionin (SAM) som en metyldonor for å metylere avdekket RNA (cap). -0) som resulterer i en cap-1 struktur.

Cap1-strukturen kan øke translasjonseffektiviteten, og forbedre uttrykket av mRNA i transfeksjons- og mikroinjeksjonseksperimenter. Dette enzymet krever spesifikt RNA med en m7GpppN-hette som substrat.Den kan ikke bruke RNA med pN, ppN, pppN eller GpppN i 5´-enden.Avdekket RNA kan fremstilles via in vitro-transkripsjon ved bruk av cap-analog eller gjennom enzymatisk avslutning ved bruk av Vaccinia Capping Enzyme.

Komponenter

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10×Capping Reaction Buffer

Oppbevaring

-25 ～- 15 ℃ for lagring （ Unngå gjentatte fryse-tine-sykluser）

Lagringsbuffer

20 mM Tris-HCl (pH 8,0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 % glyserol.

Enhetsdefinisjon

En enhet er definert som mengden enzym som kreves for å metylere 10 pmol av 80 nt-avkortet RNA-transkript i løpet av 1 time ved 37°C.

Kvalitetskontrollanalyser

Eksonuklease:50U mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase med 1μg λ-Hind III fordøyelses-DNA ved 37 ℃ i 16 timer gir ingen nedbrytning som bestemt ved agarosegelelektroforese.

Endonuklease: 50 U mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase med 1 μg λDNA ved 37 ℃ i 16 timer gir ingen nedbrytning som bestemt ved agarosegelelektroforese.

Nickase: 50U mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase med 1μg pBR322 ved 37 ℃ i 16 timer gir ingen nedbrytning som bestemt ved agarosegelelektroforese.

RNase: 50U mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase med 1,6 μg MS2 RNA i 4 timer ved 37 ℃ gir ingen nedbrytning som bestemt ved agarosegelelektroforese.

E. coli DNA: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase screenes for tilstedeværelse avE. coli genomisk DNA ved bruk av TaqMan qPCR med primere spesifikke forE. coli 16S rRNA-lokus.DeE. coli genomisk DNA-kontaminering er =1E. coli genom.

Bakteriell Endotoksin: LAL-test, i henhold til Chinese Pharmacopoeia IV 2020-utgaven, gelgrensetestmetode, generell regel (1143).Bakterielt endotoksininnhold bør være =10 EU/mg.

Reaksjonssystem og forhold

1. Kombiner en passende mengde avdekket RNA og RNase-fri H2O i et 1,5 mL mikrofugerør til et sluttvolum på 16,0 μL.

2. Varm opp til 65 ℃ i 5 minutter etterfulgt av et isbad i 5 minutter.

3. Tilsett følgende komponenter i den angitte rekkefølgen (for metylering av avkortet RNA

mindre enn 10

*10× Capping Reaction Buffer: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Inkuber ved 37 ℃ i 1 time (2 timers inkubasjon anbefales for målfragmentet mindre enn 200 nt).

applikasjoner

For å forbedre mRNA-ekspresjon under mikroinjeksjon og transfeksjonseksperimenter.

Merknader om bruk

1. Før reaksjon bør RNA renses og oppløses i nukleasefritt vann, alle løsningene skal ikke inneholde EDTA og ioner.

2. Det anbefales å varme opp prøve-RNA ved 65 ℃ i 5 minutter før reaksjonen for å fjerne den sekundære strukturen på 5'enden av transkripsjonen.Den kan utvides til 10 minutter for kompleks 5'-terminal struktur.