PNGase F
Peptid-N-glykosidase F(PNGase F) er den mest effektive enzymatiske metoden for å fjerne nesten alle N-koblede oligosakkarider fra glykoproteiner.PNGase F er en amidase, som spalter mellom de innerste GlcNAc- og asparaginrestene av høy mannose-, hybrid- og komplekse oligosakkarider fra N-koblede glykoproteiner.
applikasjon
Dette enzymet er nyttig for fjerning av karbohydratrester fra proteiner.
Forberedelse og spesifikasjon
| Utseende | Fargeløs væske |
| Proteinrenhet | ≥95 % (fra SDS-PAGE) |
| Aktivitet | ≥500 000 U/ml |
| Eksoglykosidase | Ingen aktivitet kunne oppdages (ND) |
| Endoglykosidase F1 | ND |
| Endoglykosidase F2 | ND |
| Endoglykosidase F3 | ND |
| Endoglykosidase H | ND |
| Protease | ND |
Egenskaper
| EC-nummer | 3.5.1.52(Rekombinant fra mikroorganisme) |
| Molekylær vekt | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelektrisk punkt | 8. 14 |
| Optimal pH | 7,0-8,0 |
| Optimal temperatur | 65 °C |
| Substratspesifisitet | Spaltning av glykosidbindinger mellom GlcNAc og asparaginrester Fig.1 |
| Gjenkjennelsessider | N-koblede glykaner med mindre de inneholder α1-3 fucose Fig. 2 |
| Aktivatorer | DTT |
| Inhibitor | SDS |
| Lager temperatur | -25 ~-15 ℃ |
| Varmeinaktivering | En 20 µL reaksjonsblanding som inneholder 1 µL PNGase F inaktiveres ved inkubering ved 75 °C i 10 minutter. |
Fig. 1 Substratspesifisitet til PNGase F
Fig. 2 Gjenkjennelse av PNGase F.
Når de interne GlcNAc-restene er koblet til α1-3 fucose, kan ikke PNGase F spalte N-koblede oligosakkarider fra glykoproteiner.Denne modifikasjonen er vanlig i planter og noen insektglykoproteiner.
Componenter
|
| Komponenter | Konsentrasjon |
| 1 | PNGase F | 50 ul |
| 2 | 10×Glycoprotein Denaturing Buffer | 1000 ul |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 ul |
| 4 | 10 % NP-40 | 1000 ul |
Enhetsdefinisjon
En enhet(U) er definert som mengden enzym som kreves for å fjerne >95 % av karbohydratet fra 10 µg denaturert RNase B i løpet av 1 time ved 37°C i et totalt reaksjonsvolum på 10 µL.
Reaksjonsforhold
1. Løs opp 1-20 µg glykoprotein med avionisert vann, tilsett 1 µl 10×Glycoprotein Denaturing Buffer og H2O (om nødvendig) for å lage et totalt reaksjonsvolum på 10 µl.
2.Inkuber ved 100 °C i 10 minutter, avkjøl den på is.
3.Tilsett 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10 % NP-40 og bland.
4.Tilsett 1-2 µl PNGase F og H2O (om nødvendig) for å lage et totalt reaksjonsvolum på 20 µl og bland.
5.Inkuber reaksjonen ved 37°C i 60 min.
6.For SDS-PAGE-analyse eller HPLC-analyse.
