Vaccinia Virus Capping Enzyme

Vaccinia-virusavgrensningsenzym er avledet fra en rekombinant E. coli-stamme som bærer genene for Vaccinia-avgrensningsenzymet.Dette enkeltenzymet er sammensatt av to underenheter (D1 og D12) og har tre enzymatiske aktiviteter (RNA-trifosfatase og guanylyltransferase av D1-underenheten og guaninmetyltransferase av D12-underenheten).Vaccinia virus Capping Enzyme er effektivt for å katalysere dannelsen av cap-struktur, som spesifikt kan feste 7-methylguanylate cap-strukturen (m7Gppp, Cap 0) til 5'-enden av RNA.Cap-struktur (Cap 0) spiller en viktig rolle i mRNA-stabilisering, transport og translasjon i eukaryoter.Dekking av RNA ved enzymatisk reaksjon er en effektiv og enkel metode som betydelig kan forbedre stabiliteten og translasjonen av RNA for in vitro transkripsjon, transfeksjon og mikroinjeksjon.

Komponenter

Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL)

10×Capping buffer

Lagringsforhold

-25～- 15 ℃ for lagring （ Unngå gjentatte fryse-tine-sykluser）

Lagringsbuffer

20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,

1 mM DTT, 0, 1 mM EDTA, 0, 1 % Triton X-100, 50 % glyserol.

Enhetsdefinisjon

En enhet av Vaccinia virus Capping Enzyme er definert som mengden enzym som kreves for å inkorporere 10 pmol GTP i et 80nt transkripsjon på 1 time ved 37°C.

Kvalitetskontroll

Eksonuklease:10 U av Vaccinia virus-kappingsenzym med 1 μg λ-Hind III fordøyelses-DNA ved 37 ℃ i 16 timer gir ingen nedbrytning, bestemt ved agarosegelelektroforese.

Endonuklease:10 U av Vaccinia virus-kappingsenzym med 1 μg λDNA ved 37 ℃ i 16 timer gir ingen nedbrytning, bestemt ved agarosegelelektroforese.

Nickase:10 U av Vaccinia virus-kappingsenzym med 1 μg pBR322 ved 37 ℃ i 16 timer gir ingen nedbrytning, bestemt ved agarosegelelektroforese.

RNase:10 U av Vaccinia virus Capping Enzyme med 1,6 μg MS2 RNA i 4 timer ved 37 ℃ gir ingen nedbrytning som bestemt ved agarosegelelektroforese.

1.coli DNA:10 U av Vaccinia virus Capping Enzyme screenes for tilstedeværelse av E. coli genomisk DNA ved å bruke TaqMan qPCR med primere spesifikke for E. coli 16S rRNA-lokuset.E. coli genomiske DNA-kontaminering er ≤1 E. coli-genom.

2.Bakteriell Endotoksin: LAL-test, i henhold til Chinese Pharmacopoeia IV 2020-utgaven, gelgrensetestmetode, generell regel (1143).Bakterielt endotoksininnhold bør være ≤10 EU/mg.

Reaksjonssystem og forhold

1. Capping Protocol (reaksjonsvolum: 20 μL)

Denne prosedyren er anvendelig for kappingsreaksjonen av 10μg RNA (≥100 nt), og den kan skaleres opp i henhold til eksperimentelle krav.

I) Kombiner 10 μg RNA og nukleasefri H2O i et 1,5 ml mikrofugerør til et sluttvolum på 15,0 μL.*10×Capping-buffer: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) Varm opp til 65 ℃ i 5 minutter etterfulgt av isbad i 5 minutter.

3) Legg til følgende komponenter i den angitte rekkefølgen

*10×Capping Buffer: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

4) Inkuber ved 37 °C i 30 minutter, RNA er nå avdekket og klar for nedstrømsapplikasjoner.

2. 5′ terminal merkingsreaksjon (reaksjonsvolum: 20 μL)

Denne protokollen er designet for å merke RNA som inneholder et 5' trifosfat, og den kan skaleres opp i henhold til krav.Effektiviteten av etikettinkorporering vil bli påvirket av molforholdet mellom RNA: GTP, samt GTP-innholdet i RNA-prøver.

1) Kombiner passende mengde RNA og nukleasefri H2O i et 1,5 ml mikrofugerør til et sluttvolum på 14,0 µL.

2) Varm opp til 65 ℃ i 5 minutter etterfulgt av isbad i 5 minutter.

3) Legg til følgende komponenter i den angitte rekkefølgen.

** GTP MIX refererer til GTP og et lite antall markører.For konsentrasjonen av GTP, setil note 3.

4) Inkuber ved 37 °C i 30 minutter, RNA 5′-enden er nå merket og klar for nedstrøms

applikasjoner

1. Avslutning av mRNA før translasjonsanalyser/in vitro translasjon

2. Merking av 5'-enden av mRNA

Merknader om bruk

1.Oppvarming av RNA-løsningen før inkubering med Vaccinia Capping Enzyme fjerner sekundær struktur på 5'enden av transkripsjonen.Utvid tiden til 60 minutter for transkripsjoner med kjente svært strukturerte 5-ender.

2. RNA som brukes til kappingsreaksjoner bør renses før bruk og suspenderes i nukleasefritt vann.EDTA bør ikke være tilstede og løsningen bør være fri for salter.

3. For merking av 5´-enden bør den totale GTP-konsentrasjonen være rundt 1-3 ganger den molare konsentrasjonen av mRNA i reaksjonen.

4. Volumet av reaksjonssystemet kan skaleres opp eller ned i henhold til den faktiske.