DNA-ekstraksjon minisett
Dette settet tar i bruk et optimalisert buffersystem og silikagelkolonnerenseteknologi, som kan gjenvinne 70 bp – 20 kb DNA-fragmenter fra forskjellige konsentrasjoner av TAE eller TBE agarosegel.DNA-adsorpsjonskolonne kan spesielt adsorbere DNA under høysaltforhold.I tillegg kan settet direkte rense DNA-fragmenter fra PCR-produkter, enzymatiske reaksjonssystemer eller rå DNA-produkter oppnådd ved andre metoder, og fjerne urenheter som proteiner, andre organiske forbindelser, uorganiske salioner og oligonukleotidprimere.Det kan sikre at rensingen kan fullføres innen 10-15 min.Det rensede DNA kan brukes direkte til ligering, transformasjon, enzymfordøyelse, in vitro transkripsjon, PCR, sekvensering, mikroinjeksjon, etc.
Lagringsforhold
Oppbevares ved -15 ~ -25 ℃ og transporteres ved romtemperatur.
Komponenter
| Komponenter | (100 rxns) |
| Buffer BNP | 80 ml |
| Buffer GW | 2 × 20 ml |
| Elueringsbuffer | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Buffer BNP:DNA-bindende buffer.
Buffer GW:Vaskebuffer;tilsett absolutt etanol med det angitte volumet på flasken før bruk.
Elueringsbuffer:Eluering.
FastPure DNA Mini Columns-G:DNA-adsorpsjonskolonner.
Oppsamlingsrør 2 ml:Oppsamlingsrør for filtrat.
Forberedte materialer
1,5 ml steriliserte rør, absolutt etanol og isopropanol (når DNA-fragment ≤100 bp, tilsett 1 volum
isopropanol til 1 volum gel), vannbad.
Eksperimentprosess
Tilsett 80 ml etanol for å fortynne buffer GW som angitt på etiketten før bruk, oppbevar ved romtemperatur.
Mekanisme
1. PCR-reaksjonsløsning
Gelekstraksjonsskjema: Tilsett likt volum Buffer GDP PCR-reaksjonsoppløsningsgjenvinningsskjema:Legg til 5 ganger volumbufferen
2. BNP Beregn volumet av gel(100 μl tilsvarer 100 mg)
Løs opp gel
3. Forvarm til 50 ~ 55℃
4. Bind Vask
Legg til 300 μL buffer BNP*
Tilsett 700 μL buffer GW
Tilsett 700 μL buffer GW
5. Eluter
Tilsett 20 – 30 μL elueringsbuffer eller avionisert vann
Merknader* PCR-reaksjonsvæskegjenvinning uten dette trinnet
Gelekstraksjonsprogram
1. Etter DNA-elektroforese for fraksjonering av DNA-fragmenter, skjær ut enkeltstripen med DNA-fragment fra agarosegelen under UV-lys.Det anbefales å bruke absorberende papir for å absorbere tilsynelatende fuktighet fra gelen og minimere størrelsen på gelskiven ved å fjerne ekstra agarose som mulig.Vei gelskiven (uten mikrosentrifugerør) for å beregne volumet: Volumet av 100 mg gelskive er omtrent 100 μL, forutsatt at tettheten er 1 g/ml.
2. Tilsett likt volum Buffer GDP, inkuber ved 50~55 ℃ i 7-10 minutter (i henhold til gelstørrelsen, juster inkubasjonstiden til gelen er fullstendig oppløst).Snu røret 2 ganger under inkubasjonen.
Δ Tilsetning av 1-3 volumer Buffer GDP vil ikke påvirke effektiviteten av DNA-gjenvinning.Hvis DNA-fragmentet som skal gjenvinnes <100 bp, må 3 volumer Buffer GDP tilsettes;når gelskiven er helt oppløst, tilsett 1 volum isopropanol og bland grundig, fortsett deretter til neste trinn.
3. Sentrifuger kort for å bringe prøven til bunnen av røret, sett inn FastPure DNA Mini Columns-G i oppsamlingsrørene 2 ml, overfør forsiktig løsningen maksimalt 700 μL én gang pr.
tid til filtreringskolonnene, sentrifuger ved 12 000 rpm (13 800 X g) i 30-60 sek.
4. Kast filtratet og tilsett 300 μL Buffer GDP til kolonnen, inkuber ved romtemperatur i 1 min, sentrifuger ved 12 000 rpm (13 800 X g) i 30-60 sek.
5. Kast filtratet og tilsett 700 μL Buffer GW (sjekk om absolutt etanol er tilsatt på forhånd!) til kolonnen, sentrifuger ved 12 000 rpm (13 800 X g) i 30-60 sek.
Δ Vennligst tilsett Buffer GW rundt adsorpsjonskolonneveggen, eller legg Buffer GW bakdekselet og bland det opp ned i 2 – 3 ganger for å hjelpe til med å skylle saltet som fester seg til rørveggen fullstendig.
6. Gjenta trinn 5.
Δ Skylling med Buffer GW to ganger kan sikre at saltet er fullstendig fjernet og eliminere innvirkningen på etterfølgende eksperimenter.
7. Kast filtratet og sentrifuger den tomme kolonnen ved 12 000 rpm (13 800 X g) i 2 min.
8. Sett kolonnen inn i et rent 1,5 ml mikrosentrifugerør, tilsett 20 - 30 μL elueringsbuffer til midten av kolonnemembranen, inkuber i 2 minutter og sentrifuger deretter ved 12 000 rpm (13 800 X g) i 1 min.Kast kolonnen, oppbevar det oppnådde DNA ved -20°C.
Δ Overføring av supernatanten fra trinn 8 til kolonnen for å eluere igjen og forvarming av elueringsbufferen til 55 (når DNA-fragmentet >3 kb) kan være nyttig for å øke utvinningseffektiviteten.
Gjenopprettingsprogram for PCR-produkter
Denne protokollen er anvendelig for å rense DNA-fragmenter fra PCR-produkter, enzymatiske reaksjonssystem og andre DNA-råprodukter (inkludert genetisk DNA).Denne løsningen kan effektivt fjerne ulike nukleotider, primere, primerdimerer, saltmolekyler, enzymer og andre urenheter.
1. Sentrifuger kort PCR-produkter, enzymatisk reaksjonsløsning og andre DNA-råprodukter.Estimer volumet med pipette og overfør til et sterilisert 1,5 ml eller 2 ml rør.Tilsett ddH2O til volumet er opp til 100 μL;mens for genomisk DNA med høy konsentrasjon vil fortynning til 300 μL med ddH2O bidra til å forbedre utvinningseffektiviteten.
2. Tilsett 5 volumer Buffer GDP, bland grundig ved å snu eller vortex.Hvis DNA-fragmentet av interesse >100 bp, må ytterligere 1,5 volumer (prøver + buffer-BNP) med etanol tilsettes.
3. Sett kolonnen tilbake i oppsamlingsrøret, overfør blandingen til kolonnen, sentrifuger ved 12 000 rpm (13 800 × g) i 30 – 60 sek.Hvis volumet av den blandede løsningen er >700 µL, sett adsorpsjonskolonnen tilbake i oppsamlingsrøret, overfør den gjenværende løsningen til adsorpsjonskolonnen og sentrifuger ved 12 000 rpm (13 800 × g) i 30 – 60 sek.
4. Den neste ytelsen refererer til trinn 5 – 8 i 08- 1/Gelekstraksjonsprogrammet.
applikasjoner
Ulike konsentrasjoner av TAE eller TBE agarosegel;PCR-produkter, enzymatiske reaksjonssystemer eller andre rå DNA-produkter oppnådd ved ulike metoder.Gjenvunnede fragmenter varierte fra70 bp -20 kb.
Notater
Kun til forskningsbruk.Ikke for bruk i diagnostiske prosedyrer.
1. Tilsett 80 ml etanol for å fortynne buffer GW som angitt på merkelappen før bruk, oppbevar ved romtemperatur.
2. Hvis Buffer GDP er lett å utfelle under lavtemperaturlagring, kan den plasseres i romtemperatur i en periode før bruk.Om nødvendig kan den forvarmes i et 37℃ vannbad til bunnfallet er helt oppløst, og deretter kan det brukes etter blanding.
3. Still inn vannbadstemperaturen til 50 ~55 ℃ på forhånd.
4. I 08-1/Gel ekstraksjonsprogram trinn 1, vil minimering av størrelsen på gelskiven redusere oppløsningstiden betydelig og øke utvinningseffektiviteten (linearisert DNA er lett å hydrolysere når det kontinuerlig eksponeres ved høy temperatur).Ikke utsett DNA-gelen for UV over lengre tid, da ultrafiolett lys kan forårsake DNA-skader.
5. Løs opp gelen i 08- 1/Gelekstraksjonsprogram trinn 2 fullstendig, ellers vil DNA-gjenvinningseffektiviteten bli alvorlig påvirket.
6. Forvarm elueringsbuffer eller ddH2O til 55 ℃, noe som er nyttig for å forbedre effektiviteten av DNA-elueringen.Det anbefales å lagre DNA i elueringsmiddel på 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5.
