EndoFree Plasmid Maxi Kit

Lagringsforhold

RNaseA bør lagres ved -30 ~ -15 ℃ og transporteres ved ≤0 ℃.

Endotoxin Scavenger kan lagres ved 2 ~ 8 ℃ i en måned, lagres ved -30 ~ -15 ℃ for langtidslagringog transportert ved ≤0℃.

Andre komponenter bør lagres ved romtemperatur (15 ~ 25 ℃) og transporteres ved romtemperatur.

Komponenter

RNaseA:10 mg/ml, brukt til å fjerne RNA.

Buffer P1:bakteriesuspensjonsbuffer, tilsett RNaseA til buffer P1 før første gangs bruk.

Buffer P2:bakteriell lyseringsbuffer (inneholder SDS/NaOH).

Buffer P4:nøytraliserende buffer.

Endotoksinfjerner:fjerner effektivt endotoksin fra det rå plasmidekstraktet.

Buffer PW:vaskebuffer, tilsett det angitte volumet etanol før første gangs bruk.

Buffer TB:elueringsbuffer.

FastPure DNA Maxi-kolonner:plasmid DNA adsorpsjonskolonner.

Oppsamlingsrør 50 ml:filtratoppsamlingsrør.

Endotoksinfri innsamlingsrør:plasmid DNA oppsamlingsrør.

Forberedte materialer

Absolutt etanol, isopropanol, 50 ml rundbunnede sentrifugerør og 50 ml endotoksinfrisentrifugerør.

applikasjoner

Dette produktet er egnet for storskala ekstraksjon av plasmider fra 150 - 300 ml bakterieoppløsningdyrket over natten.

Eksperimentprosess

1. Ta 150 – 200 ml (ikke mer enn 300 ml) bakterieoppløsning dyrket over natten og sentrifuger kl.ca. 11 000 rpm (12 000 × g) i 1 – 2 min.Kast supernatanten og samle bakterier.

Δ Ved oppsamling av mer enn 50 ml bakterieoppløsning, kan bakteriene samles opp ved å tilsette bakterieoppløsning, sentrifugering, kassering av supernatanten og andre trinn i det samme 50 ml-røret for

flere ganger.

2. Tilsett 7,5 ml buffer P1 (sjekk om RNaseA er tilsatt buffer P1) til sentrifugenrør som inneholder bakterier og bland grundig ved vortex eller pipettering.

Δ Fullstendig resuspensjon av bakterier i dette trinnet er avgjørende for å gi, og det skal ikke være noen bakterieklumper etter resuspensjon.Hvis det er bakterieklumper som ikke er grundig blandet, vil det påvirke lyseringen, noe som resulterer i lavt utbytte og renhet.Hvis OD600 for bakterieoppløsning er 0,65, anbefales det at 7,5 ml Buffer P1 brukes ved ekstrahering fra 150 ml bakterieoppløsning;når OD600 er 0,75, bør 8 ml Buffer P1 brukes og volumene av Buffer P2 og P4 bør endres tilsvarende.Hvis volumet av bakterieoppløsningen økes til 200 ml, anbefales det atvolumet av buffere P1, P2 og P4 økes proporsjonalt.

3. Tilsett 7,5 ml buffer P2 til bakteriesuspensjonen fra trinn 2 og bland forsiktig opp og ned i 6 – 8ganger og inkuber ved romtemperatur i 4 – 5 min.

Δ Vend forsiktig for å blande grundig.Vortexing vil forårsake den genomiske DNA-fragmenteringen, noe som resulterer i genomiske DNA-fragmenter i det ekstraherte plasmidet.På dette tidspunktet blir løsningen tyktflytende og gjennomskinnelig, noe som viser at bakteriene er fullstendig lysert.Varigheten bør ikke overstige 5 minutter for å unngå ødeleggelse av plasmidene.Hvis løsningen ikke er klar, kan det være for mange bakterier som resulterer iufullstendig lysis, så mengden av bakterier bør reduseres på passende måte.

4. Tilsett 7,5 ml buffer P4 til bakteriesuspensjonen fra trinn 3 og snu umiddelbart forsiktig 6 – 8 ganger for å la løsningen nøytralisere buffer P2 fullstendig.På dette tidspunktet skal det vises hvitt flokkulent bunnfall.Sentrifuger ved mer enn ca. 11 000 rpm (12 000 × g) i 10 – 15 minutter, pipett supernatanten forsiktig inn i et nytt 50 ml rundbunnet sentrifugerør (selvforberedt), og unngåaspirer det flytende hvite bunnfallet.

Δ Tilsett buffer P4 og vend umiddelbart for å blande godt.La røret stå til det hvite bunnfallet er fordelt jevnt gjennom løsningen for å forhindre produksjon av lokal nedbør som kan påvirke nøytraliseringen.Hvis det ikke er ensartet hvitt flokkulent bunnfall før sentrifugering og supernatanten ikke er klar etter sentrifugering, kan røretsentrifugert i ytterligere 5 min.

5. Tilsett 0,1 ganger volumet (10 % av supernatantvolumet, ca. 2,2 ml) Endotoxin Scavenger til supernatanten fra trinn 4 og vend for å blande.Plasser løsningen i et isbad eller sett inn i knust is (eller kjøleskap med fryser) i 5 minutter til løsningen endres fra grumsete til klar og gjennomsiktig (eller fortsattlitt grumsete), og bland av og til flere ganger.

Δ Etter at Endotoxin Scavenger er tilsatt til supernatanten, vil supernatanten bli grumsete, mensupernatanten skal bli klar (eller litt grumsete) etter avkjøling i isbadet.

6. Etter at supernatanten er plassert ved romtemperatur (>25 ℃) i 10 – 15 minutter, vil den bli grumset ettersomtemperaturen øker til romtemperatur.Deretter bør supernatanten snus for å blandes.

Δ Hvis romtemperaturen er lavere eller du ønsker å redusere ekstraksjonstiden, kan supernatanten inkuberes i et 37 ~ 42 ℃ vannbad i 5 – 10 minutter og neste trinn kan utføres etter supernatantenblir grumsete.

7. Sentrifuger supernatanten ved ca. 11 000 rpm (12 000 × g) i 10 minutter ved romtemperatur (temperaturen må være >25 ℃) for å skille fasen.Den øvre vandige fasen inneholder DNA, mens det nedre blå oljefaselaget inneholder endotoksin og andre urenheter.OverførDNA-holdig vandig fase til et nytt rør ogkast det oljeaktige laget.

Δ Temperaturen under sentrifugering må være over 25 ℃, da effektiv faseseparasjon ikke gjør detoppstår hvis temperaturen er for lav.

Δ Hvis faseseparasjonen ikke er effektiv, kan sentrifugeringstemperaturen justeres til 30 ℃ ogsentrifugeringstiden kan økes til 15 min.

Δ Ikke sug det blå oljeaktige laget siden det inneholder endotoksin og andre urenheter.

Mekanisme

Resuspensjon Lysis Nøytralisering

◇ Tilsett 7,5 ml buffer P1

◇ Tilsett 7,5 ml buffer P2

◇ Tilsett 7,5 ml buffer P4

Endotoksin fjerning

◇ Tilsett 0,1 ganger supernatantvolumet av Endotoxin Scavenger

Innbinding og vasking

◇ Tilsett 0,5 ganger volumet av isopropanol

◇ Tilsett 10 ml buffer PW