M-MLV Neoscript Revers Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase er en revers transkriptase oppnådd ved mutasjonsscreening av M-MLV-genet av Moloney murine leukemivirus opprinnelse og uttrykk i E.coli.Enzymet fjerner RNase H-aktivitet, har høyere temperaturtoleranse og er egnet for høytemperatur revers transkripsjon.Derfor er det nyttig for å eliminere de ugunstige effektene av RNA-høynivåstrukturen og ikke-spesifikke faktorer på cDNA-syntese, og har høyere stabilitet og revers transkripsjonssynteseevne.Enzymet har høyere stabilitet og revers transkripsjonssynteseevne.
Komponenter
1.200 U/μL Neoscript Revers Transcriptase
2.5 × First-Strand Buffer (valgfritt)
* 5 × First-Strand Buffer inneholder ikke dNTP, vennligst legg til dNTP når du klargjør reaksjonssystemet
Anbefalt søknad
1.Ett-trinns QRT-PCR.
2.Påvisning av RNA-virus.
Lagringsforhold
-20°C for langtidsoppbevaring, bør blandes godt før bruk, unngå hyppig frys-tine.
Enhetsdefinisjon
En enhet inkorporerer 1 nmol dTTP på 10 minutter ved 37°C ved bruk av poly(A)•oligo(dT)25som mal/primer.
Kvalitetskontroll
1.SDS-PAGE elektroforetisk renhet større enn 98 %.
2.Amplifikasjonsfølsomhet, batch-til-batch-kontroll, stabilitet.
3.Ingen eksogen nukleaseaktivitet, ingen eksogen endonuklease eller eksonukleasekontaminering
Reaksjonsoppsett for førstekjedereaksjonsløsning
1.Fremstilling av reaksjonsblandingen
| Komponenter | Volum |
| Oligo(dT)12-18 Primer eller Random Primeren Eller genspesifikke primereb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Mal RNA | Totalt RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNase-fri dH2O | Til 10 μL |
Merknader:a/b: Velg forskjellige typer primere i henhold til dine eksperimentelle behov.
2.Varm opp til 65 °C i 5 minutter og avkjøl raskt på is i 2 minutter.
3.Tilsett følgende komponenter til systemet ovenfor til et totalt volum på 20 µL og bland forsiktig:
| Komponenter | Volum (μL) |
| 5 × første-streng buffer | 4 |
| Neoscript omvendt transkriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase-hemmer (40 U/μL) | 1 |
| RNase-fri dH2O | Til 20 μL |
4. Utfør reaksjonen i henhold til følgende forhold:
(1) Hvis Random Primer brukes, bør reaksjonen utføres ved 25 ℃ i 10 minutter, og deretter ved 50 ℃ i 30-60 minutter;
(2) Hvis Oligo dT eller spesifikke primere brukes, bør reaksjonen utføres ved 50 ℃ i 30~60 minutter.
5.Varm opp til 95 ℃ i 5 minutter for å inaktivere Neoscript Reverse Transcriptase og avslutte reaksjonen.
6.Omvendt transkripsjonsprodukter kan brukes direkte i PCR-reaksjon og fluorescenskvantitativ PCR-reaksjon, eller lagres ved -20 ℃ i lang tid.
PCR Rhandling:
1.Fremstilling av reaksjonsblandingen
| Komponenter | Konsentrasjon |
| 10 × PCR-buffer (dNTP-fri, Mg²+ fri) | 1× |
| dNTP-er (10 mM hver dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA-polymerase (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Malen | ≤10 % førstekjedereaksjonsløsning (2 μL) |
| ddH2O | Til 50 μL |
Merknader:a: Hvis for mye førstekjedereaksjonsløsning tilsettes, kan PCR-reaksjonen hemmes.
2.PCR-reaksjonsprosedyre
| Steg | Temperatur | Tid | Sykluser |
| Pre-denaturering | 95 ℃ | 2-5 minutter | 1 |
| Denaturering | 95 ℃ | 10-20 sek | 30-40 |
| Gløding | 50-60 ℃ | 10-30 sek | |
| Utvidelse | 72℃ | 10-60 sek |
Notater
1.Egnet for omvendt transkripsjonstemperaturoptimalisering i området 42℃~55℃.
2.Den har bedre stabilitet, er egnet for høytemperatur revers transkripsjonsforsterkning.I tillegg er det gunstig for effektivt å passere gjennom komplekse strukturelle regioner av RNA.Også deter egnet for ett-trinns multipleks fluorescens kvantitativ RT-PCR-deteksjon.
3.God kompatibilitet med ulike PCR-amplifikasjonsenzymer og er egnet for høysensitive RT-PCR-reaksjoner.
4.Egnet for en-trinns fluorescens kvantitativ RT-PCR-reaksjon med høy sensitivitet, forbedrer effektivt deteksjonshastigheten for lav konsentrasjon av maler.
5.Egnet for cDNA-bibliotekkonstruksjon.
