RNAse-hemmer
Murin RNase-hemmer er en rekombinant murin RNase-hemmer uttrykt og renset fra E.coli.Den binder seg til RNase A, B eller C i forholdet 1:1 gjennom ikke-kovalent binding, og hemmer dermed aktiviteten til de tre enzymene og beskytter RNA mot nedbrytning.Imidlertid er det ikke effektivt mot RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H eller RNase fra Aspergillus.Murin RNase-hemmer ble testet med RT-PCR, RT-qPCR og IVT mRNA, og var kompatibel med ulike kommersielle revers transkriptaser, DNA-polymeraser og RNA-polymeraser.
Sammenlignet med humane RNase-hemmere inneholder ikke murin RNase-hemmer to cysteiner som er svært følsomme for oksidasjon som forårsaker inaktivering av inhibitoren.Det gjør den stabil ved lave konsentrasjoner av DTT (mindre enn 1 mM).Denne funksjonen gjør den egnet for bruk i reaksjoner der høye konsentrasjoner av DTT er ugunstig for reaksjonen (f.eks. sanntids RT-PCR).
Aapplikasjon
Dette produktet kan brukes mye i ethvert eksperiment der RNase-interferens er mulig for å unngå RNA-nedbrytning, for eksempel:
1.Syntese av den første strengen av cDNA, RT-PCR, RT-qPCR, etc.
2.Beskytter RNA mot nedbrytning under in vitro transkripsjon/translasjon (f.eks. in vitro virusreplikasjonssystem).
3.Hemming av RNase-aktivitet under RNA-separasjon og rensing.
Lagringsforhold
Produktet kan lagres ved -25～- 15 ℃, gyldig i 2 år.
Lagringsbuffer
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT og 50 % glyserol.
Enhetsdefinisjon
Mengden murin RNase-hemmer som kreves for å hemme aktiviteten til 5 ng ribonuklease A med 50 %, ble definert som én enhet (U).
Molekylvekt av protein
Molekylvekten til murin RNase-hemmer er 50 kDa.
Kvalitetskontroll
Eksonuklease Aktivitet:
40 U murin RNase-hemmer med 1 μg λ -Hind III-fordøyelses-DNA ved 37 ℃ i 16 timer gir ingen nedbrytning, bestemt ved agarosegelelektroforese.
Endonukleaseaktivitet:
40 U murin RNase-hemmer med 1μ g λ DNA ved 37 ℃ i 16 timer gir ingen nedbrytning som bestemt ved agarosegelelektroforese.
Nicking Aktivitet:
40U murin RNase-hemmer med 1μ g pBR322 ved 37 ℃ i 16 timer gir ingen nedbrytning, bestemt ved agarosegelelektroforese.
RNase Aktivitet:
40U murin RNase-hemmer med 1,6 μ g MS2 RNA i 4 timer ved 37 ℃ gir ingen nedbrytning som bestemt ved agarosegelelektroforese.
E.coli DNA:
40 U murin RNase-hemmer screenes for tilstedeværelse av E. coli genomisk DNA ved bruk av TaqMan qPCR med primere spesifikke for E. coli 16S rRNA-lokuset.E. coli genomisk DNA-kontaminering er ≤ 0,1 pg/40 U.
Nmerknads
1. Voldsom svingning eller omrøring vil føre til enzyminaktivering.
2. Det optimale temperaturområdet for denne inhibitoren var 25-55 ℃, og den ble inaktivert ved 65 ℃ og over.
3. Aktivitetene til RNase H, RNase 1 og RNase T1 ble ikke hemmet av murin RNase-hemmer.
4. Inhiberingen av RNase-aktivitet ble funnet i et bredt område av pH (pH 5-9 var alle aktive), og den høyeste aktiviteten ble observert ved pH 7-8.
5. Siden ribonukleaser vanligvis beholder aktivitet under denaturerende forhold, må man passe på å unngå denaturering av RNase-hemmermolekyler som har kompleksdannet med en ribonuklease.For å forhindre frigjøring av aktiv ribonuklease bør temperaturer over 50 °C og høye konsentrasjoner av urea eller andre denaturerende midler unngås.
