Plant direkte PCR-sett

Kat.nr.: HCR2020A

Plant Direct PCR Kit er egnet for direkte amplifisering av planteblader, frø, etc., og kan brukes til high-throughput screening av planteprøver som ikke inneholder polysakkarider og polyfenoler.Den direkte amplifikasjons-DNA-polymerasen basert på den rettet utvikling har overlegen toleranse for PCR-hemmere i planter.I mellomtiden opprettholder den den høye amplifikasjonsytelsen, som er egnet for amplifisering av DNA-fragmenter innenfor 5 kb.Den unike lysisbufferen A i settet kan brukes til å lysere ferskt eller frossent plantevev.Det er enkelt å betjene og lysatet kan brukes som mal for amplifikasjon uten rensing.Systemet inneholder beskyttelsesmidler som gjør at råprøver effektivt kan forsterkes etter gjentatt frysing og tining.2 × Plant Direct Master Mix trenger bare å legge til primere og maler for å utføre amplifikasjonsreaksjon, og dermed redusere pipettering og forbedre deteksjonsgjennomstrømning og reproduserbarhet av resultater.

Komponenter

*Plant Direct Lysis Buffer B er en valgfri reagens som brukes til å nøytralisere Plant Direct Lysis Buffer A for å forlenge lagringstiden for prøver.Den kan brukes i henhold til den faktiske situasjonen.

Lagringsforhold

2 × Plant Direct Master Mix, lagre ved -30 ~ -15 ℃ og unngå gjentatt frysing og tining;Plant direkte lyseringsbuffer, lagre ved -30 ~ -15 ℃ eller 2 ~ 8 ℃.

Eksperimentprosess

Prøvebehandling–Planteblad

Direkte metode:Det anbefales å bruke unge blader.Bruk en hullstans med en fast diameter på 0,5 – 3 mm for å få en liten og jevn prøve, og legg deretter prøven direkte til PCR-systemet (50 μl system anbefales).Merk at prøven er i PCR-løsningen og ikke mot rørveggen.Hvis direkte PCR brukes til å amplifisere lange fragmenter og komplekse prøver, kan bruk av en prøve med en mindre diameter (0,5 – 1 mm) som mal bidra til å oppnå bedre resultater.

Slipelyseringsmetode:Det anbefales å bruke unge blader.Ta et lite stykke blad (ca. 1 – 3 mm i diameter), legg det i 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, og slip det så mye som mulig (dette trinnet kan gjøres ved å klemme bladet med en 100 μl pipettespiss å mose prøven).Hvis det brukes større volumer av bladvev (ikke over 7 mm), øk volumet av fortynningsbuffer til 50 μl.Etter at bladene er malt, skal løsningen virke grønn.Etter en kort sentrifugering, tilsett 1 μl av supernatanten til PCR-systemet som en reaksjonsmal.

Termisk lyseringsmetode:Det anbefales å bruke unge blader.Ta et lite stykke blad (ca. 1 – 3 mm i diameter), legg det i 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, og varm det opp ved 95°C i 5 – 10 min.Lyseringstiden kan forlenges passende for blader som er vanskelige å lysere (ikke mer enn 20 min).Hvis det brukes større volumer av bladvev (ikke over 7 mm), øk volumet av fortynningsbuffer til 50 μl.Etter oppvarming, sentrifuger kort og tilsett 1 μl supernatant til PCR-systemet som en reaksjonsmal.

Prøvebehandling– Plantefrø

Slipelyseringsmetode:Bruk en skalpell til å kutte frø med en diameter på 5 mm, tilsett dem til 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, og slip prøven med en pipettespiss eller andre verktøy.Vortex kort og la stå i romtemperatur i 3 – 5 min.Sørg for at frøprøven er nedsenket i fortynningsbufferen.Etter en kort sentrifugering, tilsett 1 μl av supernatanten til PCR-systemet som en reaksjonsmal.

Termisk lyseringsmetode:Bruk en skalpell til å kutte frø med en diameter på 5 mm, tilsett dem til 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, og varm opp ved 95°C i 5 – 10 min.Lyseringstiden kan forlenges passende for blader som er vanskelige å lysere (ikke mer enn 30 min).Etter oppvarming, sentrifuger kort og tilsett 1 μl supernatant til PCR-systemet som en reaksjonsmal.

en.Saks eller andre verktøy kan også brukes til å kutte prøver av passende størrelse;hvis stansen eller saksen gjenbrukes, bør de rengjøres med 2 % natriumhypoklorittløsning før hver bruk for å forhindre krysskontaminering mellom prøvene.

b.Sørg for at Plant Direct Lysis Buffer er helt smeltet før bruk.Hvis bufferen er tyktflytende eller har utfellinger, kan den varmes opp til 37 ℃ for å smelte den helt før bruk.

c.Volumet av mal i reaksjonssystemet kan justeres hensiktsmessig i henhold til forskjellen i volumet av plantemateriale og tilsatt fortynningsmiddel.

Plant direkte lysisbuffer

Plant Direct Lysis Buffer A i dette produktet er strengt optimalisert for å frigjøre genomet til de fleste plantevev og er egnet for korttidslagring av råplanter ved 4 ℃.Hvis prøven må lagres over lengre tid (f.eks. 1 – 2 måneder), anbefales det å overføre supernatanten til et nytt EP-rør og lagre det ved -20 ℃.For å lagre prøvene mer stabilt, tilsett et like stort volum Plant Direct Lysis Buffer B til den overførte supernatanten, bland godt og oppbevar ved -20 ℃.Den stabile lagringstiden varierer med planteprøver og tilstander.

Reaksjonssystem

en.Den inneholder Mg²⁺ved en sluttkonsentrasjon på 2 mM.

b.Det anbefales å bruke en sluttkonsentrasjon på 0,4μM for hver primer.Overdreven bruk av primere vil føre til økt uspesifikk amplifikasjon.

c.Mengden prøve som brukes kan justeres i henhold til den faktiske situasjonen.Mengden som brukes i en enkelt reaksjon av rå lysert prøve kan justeres mellom 2% - 20% av det totale volumet av reaksjonen.Bruk av for mange prøver kan føre til forsterkningssvikt.

Reaksjonsprogram

en.Innledende denaturering (98 ℃, 5 min) fremmer lysis av plantevev, og frigjør genomisk DNA som kan brukes til PCR-amplifisering.Ikke forkort tiden eller senk temperaturen.

b.Det anbefales å sette den lik primer-Tm-verdien eller 2 ~ 4℃ høyere enn Tm-verdien.Den direkte amplifikasjons-DNA-polymerasen som brukes i dette produktet er forskjellig fra konvensjonell Taq DNA-polymerase, og har spesielle krav til reaksjons-annealingstemperaturen; bruk av høy annealingstemperatur kan effektivt redusere uspesifikk amplifikasjon og forbedre amplifikasjonseffektiviteten.For komplekse maler kan den effektive forsterkningen oppnås ved å justere glødetemperaturen og forlenge forlengelsestiden.

c.Hvis lengden på amplifikasjonsproduktet er ≤1 kb, settes forlengelsestiden til 30 sek/kb;hvis lengden på amplifikasjonsproduktet er >1 kb, settes forlengelsestiden til 60 sek/kb.

d.For komplekse prøver eller prøver med lavt amplifikasjonsutbytte, kan antallet sykluser økes til 40-50 sykluser.

applikasjoner

Den er anvendelig for direkte amplifikasjon av plantevev og screening med høy gjennomstrømning av planteprøver som ikke inneholder polysakkarider og polyfenoler.

Notater

Kun til forskningsbruk.Ikke for bruk i diagnostiske prosedyrer.

1. For råplanteamplifikasjon eller direkte amplifikasjon anbefales det å bruke renset genomisk DNA som en positiv kontroll før forsøket startes for å sikre at systemet, primerne og operasjonene er korrekte.

2. Den direkte amplifikasjons-DNA-polymerasen som brukes i dette settet har sterk korrekturlesingsaktivitet.Hvis TA-kloning må utføres, anbefales det å rense DNA før adenin tilsettes.

3. Grunningsdesignveiledning:

en.Det anbefales at den siste basen i 3′-enden av primeren skal være G eller C.

b.Påfølgende feiltilpasninger bør unngås i de siste 8 basene på 3′-enden av primeren.c.Unngå hårnålsstrukturer i 3′-enden av primeren.

d.Forskjellene i Tm-verdien til den fremre primeren og den reverserte primeren bør ikke være mer enn 1 ℃ og Tm-verdien bør justeres til 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5 anbefales for å beregne Tm-verdien).

e.Ekstra ekstra primersekvenser som ikke er matchet med malen, bør ikke inkluderes ved beregning av primer Tm-verdi.

f.Det anbefales at GC-innholdet i primeren er 40 % -60 %.

g.Den totale fordelingen av A, G, C og T i primeren bør være så jevn som mulig.Unngå å bruke områder med høyt GC- eller AT-innhold.

h.Unngå tilstedeværelsen av komplementære sekvenser på 5 eller flere baser enten i primeren eller mellom to primere og unngå tilstedeværelsen av komplementære sekvenser på 3 eller flere baser i 3'-enden av to primere.

Jeg.Bruk NCBI BLAST-funksjonen for å sjekke spesifisiteten til primeren for å forhindre uspesifikk amplifikasjon.