RTL omvendt transkriptase
RTL revers transkriptase er en RNA-templateavhengig DNA-polymerase som mangler 3'→5'-eksonukleaseaktiviteten og har RNase H-aktivitet.Dette enzymet kan bruke RNA som en mal for å syntetisere en komplementær DNA-streng, som kan brukes på første-strengs cDNA-syntese, spesielt for RT-LAMP (loop-mediert isotermisk amplifikasjon).Sammenlignet med RTL revers transkriptase 1.0 er sensitiviteten betydelig forbedret, den termiske stabiliteten er sterkere, og reaksjonen ved 65°C er mer stabil.RTL revers transkriptase (glyserolfri) kan brukes til å fremstille lyofiliserte preparater, lyofiliserte RT-LAMP-reagenser etc.
Enhetsdefinisjon
En enhet inkorporerer 1 nmol dTTP i syreutfellbart materiale i løpet av 20 minutter ved 50°C ved bruk av poly(A)•oligo(dT)25 som mal-primer.
Komponenter
| Komponent | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL omvendt transkriptase (glyserolfri) (15 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL-buffer | 1,5 ml | 4×1,5 ml | 5×10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2×1,5 ml | 3×10 ml |
Lagringsforhold
Transport under 0°C og lagres ved -25°C~-15°C.
Kvalitetskontroll
- Restaktivitet avEndonuklease:En 50 μL reaksjon som inneholder 1 μg λDNA og 15 enheter RTL2.0 inkubert i 16 timer ved 37 ℃ viser samme mønster som negativ kontroll ved gelelektroforese.
- Restaktivitet avEksonuklease:En 50 μL reaksjon som inneholder 1 μg Hind Ⅲ-fordøyet λDNA og 15 enheter RTL2.0 inkubert i 16 timer ved 37 ℃ viser samme mønster som negativ kontroll ved gelelektroforese.
- Restaktivitet avNickase:En 50 μL reaksjon inneholdende 1 μg supercoiled pBR322 og 15 enheter RTL2.0 inkubert i 4 timer ved 37°C viser samme mønster som negativ kontroll ved gelelektroforese.
- Restaktivitet avRNase:En 10 μL reaksjon som inneholder 0,48 μg MS2 RNA og 15 enheter RTL2.0 inkubert i 4 timer ved 37 °C viser samme mønster som negativ kontroll ved gelelektroforese.
- E coli gDNA:Målt medE colispesifikke HCD-deteksjonssett, 15 enheter RTL2.0 inneholder mindre enn 1E coligenom.
Reaksjonsoppsett
cDNA-synteseprotokoll
| Komponenter | Volum |
| Mal RNA a | valgfri |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) eller Random Primer-blanding (60uM) | 2 μL |
| dNTP-miks (10 mM hver) | 1 μL |
| RNase-hemmer (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL-buffer | 2 μL |
| Nukleasefritt vann | Opptil 20 μL |
Merknader:
1) Den anbefalte dosen av totalt RNA er 1ng~1μg
2) Den anbefalte dosen av mRNA var 50ng~100ng
Termo-sykling Forutsetninger for en rutine reaksjon:
| Temperatur (°C) | Tid |
| 25 °Ca | 5 minutter |
| 55 °C | 10 minutterb |
| 80 °C | 10 minutter |
Merknader:
1) Hvis Random Primer Mix brukes, et inkubasjonstrinn ved 25°C.
2) Hvis målprimerblanding brukes, et inkubasjonstrinn ved 55°C i 10~30 minutter.
RT-LAMP-protokoll
| Komponenter | Volum | Endelig konsentrasjon |
| Mal RNA | valgfri | ≥10 eksemplarer |
| dNTP-miks (10 mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| FIP/BIP-primere (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| F3/B3 Primere (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| LoopF/LoopB Primere (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| RNase-hemmer (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reaksjon |
| RTL Revers Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U/Reaksjon |
| Bst V2 DNA-polymerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reaksjon |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (totalt 8 mM) |
| 10×HC RTL-buffer (eller 10×HC Bst V2-buffer) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Nukleasefritt vann | Opptil 25 μL | - |
Merknader:
1) Bland ved vortexing og sentrifuger kort for å samle.Konstant temperaturinkubering ved 65°C i 1 time.
2) De to bufferne er interoperable og har samme sammensetning.
Notater
1. Dette produktet vil danne et hvitt fast stoff når det lagres ved -20 °C.Ta den ut fra -20°C og legg den på is i ca 10 minutter.Etter smelting kan den brukes ved å riste og blande.
2. cDNA-produktet kan lagres ved -20°C eller -80°C eller brukes umiddelbart for PCR-reaksjon.
3. For å forhindre RNase-kontaminering, vennligst hold forsøksområdet rent, og bruk rene hansker og masker under drift.
