Mus Genotyping Kit
Kat.nr.: HCR2021A
Dette produktet er et sett designet for rask identifikasjon av musegenotyper, inkludert DNA-råekstraksjon og PCR-amplifikasjonssystem.Produktet kan brukes til PCR-amplifisering direkte fra musehale, øre, tå og annet vev etter enkel spalting med Lysis Buffer og Proteinase k.Ingen fordøyelse over natten, fenol-kloroform-ekstraksjon eller kolonnerensing, noe som er enkelt og forkorter tidkrevende eksperimenter.Produktet er egnet for amplifisering av målfragmenter opp til 2 kb og multiplekse PCR-reaksjoner med opptil 3 par primere.2×Mouse Tissue Direct PCR-blandingen inneholder genetisk konstruert DNA-polymerase, Mg2+, dNTP-er og et optimalisert buffersystem for å gi høy amplifikasjonseffektivitet og hemmertoleranse, slik at PCR-reaksjoner kan utføres ved å legge til template og primere og rehydrere produktet til 1×.PCR-produktet amplifisert med dette produktet har en fremtredende "A"-base i 3'-enden og kan brukes direkte for TA-kloning etter rensing.
Komponenter
| Komponent | Størrelse |
| 2×Muse Tissue Direct PCR Mix | 5×1,0 ml |
| Lysisbuffer | 2×20 ml |
| Proteinase K | 800 μL |
Lagringsforhold
Produktene bør lagres ved -25~-15 ℃ i 2 år.Etter tining kan Lysis Buffer lagres ved 2~8 ℃ for kortvarig flerbruk, og bland godt ved bruk.
applikasjon
Dette produktet er egnet for mus knockout-analyse, transgen deteksjon, genotyping og så videre.
Egenskaper
1.Enkel operasjon: ikke nødvendig å trekke ut genomisk DNA;
2.Bred applikasjon: egnet for direkte amplifikasjon av ulike musevev.
Bruksanvisning
1.Frigjøring av genomisk DNA
1) Fremstilling av lysat
Vevslysat tilberedes i henhold til antall museprøver som skal lyseres (vevslysat bør tilberedes på stedet i henhold til doseringen og blandes grundig for bruk), og andelen reagenser som kreves for en enkelt prøve er som følger:
| Komponenter | Volum (μL) |
| Proteinase K | 4 |
| Lysisbuffer | 200 |
2) Prøveforberedelse og lyse
Anbefalt bruk av vev
| Type avVev | Anbefalt volum |
| Musehale | 1-3 mm |
| Mus øre | 2-5 mm |
| Mustå | 1-2 stykker |
Ta en passende mengde musevevsprøver i rene sentrifugerør, tilsett 200 μL ferskt vevslysat til hvert sentrifugerør, vortex og rist, inkuber deretter ved 55 ℃ i 30 minutter, og varm deretter opp ved 98 ℃ i 3 minutter.
3) Sentrifugering
Rist lysatet godt og sentrifuger ved 12 000 rpm i 5 minutter.Supernatanten kan brukes som mal for PCR-amplifikasjon.Hvis malen er nødvendig for lagring, overfør supernatanten til et annet sterilt sentrifugerør og oppbevar ved -20 ℃ i 2 uker.
2.PCR-amplifikasjon
Fjern 2×Mouse Tissue Direct PCR-blandingen fra -20 ℃ og tin på is, bland opp ned og klargjør PCR-reaksjonssystemet i henhold til følgende tabell (operer på is):
| Komponenter | 25μLSystem | 50μLSystem | Endelig konsentrasjon |
| 2×Muse Tissue Direct PCR Mix | 12,5 μL | 25 μL | 1× |
| Primer 1 (10 μM) | 1,0 μL | 2,0 μL | 0,4 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 1,0 μL | 2,0 μL | 0,4 μM |
| Spaltningsprodukta | Etter behov | Etter behov |
|
| ddH2O | Opptil 25μL | Opptil 50μL |
|
Merk:
a) Mengden som tilsettes bør ikke overstige 1/10 av systemet, og hvis for mye tilsettes, kan PCR-amplifikasjon hemmes.
Anbefalte PCR-betingelser
| Syklustrinn | Temp. | Tid | Sykluser |
| Innledende denaturering | 94℃ | 5 minutter | 1 |
| Denaturering | 94℃ | 30 sek | 35-40 |
| Glødinga | Tm+3~5℃ | 30 sek | |
| Utvidelse | 72℃ | 30 sek/kb | |
| Endelig utvidelse | 72℃ | 5 minutter | 1 |
| - | 4℃ | Holde | - |
Merk:
a) Glødetemperatur: Med referanse til Tm-verdien til primeren, anbefales det å sette annealingstemperaturen til den mindre Tm-verdien til primeren +3~5℃.
Vanlige problemer og løsninger
1.Ingen målrettede strimler
1) Overdreven lyseringsprodukt.Velg den mest passende mengde mal, vanligvis ikke mer enn 1/10 av systemet;
2) For stor prøvestørrelse.Fortynn lysatet 10 ganger og forsterk deretter, eller reduser prøvestørrelsen og re-lysis;
3) Vevsprøver er ikke ferske.Det anbefales å bruke ferske vevsprøver;
4) Dårlig primerkvalitet.Bruk genomisk DNA for amplifikasjon for å verifisere primerkvaliteten og optimalisere primerdesignet.
2.Ikke-spesifikk forsterkning
1) Glødetemperaturen er for lav og syklusnummeret er for høyt.Øk utglødningstemperaturen og reduser antall sykluser;
2) Malkonsentrasjonen er for høy.Reduser mengden mal eller fortynn malen 10 ganger etter amplifikasjon;
3) Dårlig primerspesifisitet.Optimaliser primerdesignet.
Notater
1.For å unngå krysskontaminering mellom prøver, bør flere prøvetakingsverktøy klargjøres, og overflaten på verktøyene kan rengjøres med 2 % natriumhypoklorittløsning eller nukleinsyrerens etter hver prøvetaking hvis gjentatt bruk er nødvendig.
2.Det anbefales å bruke ferskt musevev, og prøvetakingsvolumet bør ikke være for stort for å unngå å påvirke amplifikasjonsresultatene.
3.Lysisbuffer bør unngå hyppig frysing-tining, og kan lagres ved 2~8 ℃ for kortvarig flergangsbruk.Ved lagring ved lav temperatur kan nedbør forekomme, og må løses helt opp før bruk.
4.PCR Mix bør unngå hyppig frysing-tining, og kan oppbevares ved 4 ℃ for kortvarig gjentatt bruk.
5.Dette produktet er kun for vitenskapelig eksperimentell forskning og skal ikke brukes i klinisk diagnose eller behandling.
