Proteinase K mNGS (væske)
Proteinase K er en stabil serinprotease med bred substratspesifisitet.Det bryter ned mange proteiner i den opprinnelige tilstanden selv i nærvær av vaskemidler.Bevis fra krystall- og molekylstrukturstudier indikerer at enzymet tilhører subtilisinfamilien med en katalytisk triade med aktivt sted (Asp39-Hans69-Ser224).Det dominerende spaltningsstedet er peptidbindingen ved siden av karboksylgruppen til alifatiske og aromatiske aminosyrer med blokkerte alfa-aminogrupper.Det brukes ofte for sin brede spesifisitet.Denne proteinase K er spesielt designet for mNGS.Sammenlignet med den andre proteinase K, inneholder den enda mindre nukleinsyreforurensning med samme enzymatiske ytelse, noe som bedre kan sikre nedstrøms mNGS-applikasjonen.
Lagringsforhold
2-8 ℃ i 2 år
Spesifikasjon
| Utseende | Fargeløs til lysebrun væske |
| Aktivitet | ≥800 U/ml |
| Proteinkonsentrasjon | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Ingen oppdaget |
| DNase | Ingen oppdaget |
| RNase | Ingen oppdaget |
Egenskaper
| EC-nummer | 3.4.21.64(Rekombinant fra Tritirachium album) |
| Isoelektrisk punkt | 7,81 |
| Optimal pH | 7.0- 12.0 Fig. 1 |
| Optimal temperatur | 65 ℃ Fig. 2 |
| pH-stabilitet | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 timer) Fig. 3 |
| Termisk stabilitet | Under 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Fig. 4 |
| Lagringsstabilitet | Over 90 % aktivitet i 12 måneder ved 25 ℃ |
| Aktivatorer | SDS, urea |
| Inhibitorer | diisopropylfluorfosfat;fenylmetylsulfonylfluorid |
applikasjoner
1. Genetisk diagnosesett
2. RNA- og DNA-ekstraksjonssett
3. Ekstraksjon av ikke-proteinkomponenter fra vev, nedbrytning av proteinurenheter, slik som DNAvaksiner og tilberedning av heparin
4. Fremstilling av kromosom-DNA ved pulserende elektroforese
5. Western blot
6. Enzymatisk glykosylerte albuminreagenser in vitro-diagnose
Forholdsregler
Bruk vernehansker og vernebriller ved bruk eller veiing, og hold godt ventilert etter bruk.Dette produktet kan forårsake hudallergiske reaksjoner og alvorlig øyeirritasjon.Ved innånding kan det forårsake allergi- eller astmasymptomer eller dyspné.Kan forårsake irritasjon i luftveiene.
Enhetsdefinisjon
En enhet (U) er definert som mengden enzym som kreves for å hydrolysere kasein for å produsere 1 μmoltyrosin per minutt under følgende forhold.
Klargjøring av reagenser
Reagens I: 1 g melkekasein ble oppløst i 50 ml 0,1 M natriumfosfatløsning (pH 8,0), inkubert i 65-70 ℃ vann i 15 minutter, omrørt og oppløst, avkjølt med vann, justert med natriumhydroksid til pH 8,0 og fast volum 100 ml.
Reagens II: 0,1 M trikloreddiksyre, 0,2 M natriumacetat, 0,3 M eddiksyre.
Reagens III: 0,4M Na2CO3løsning.
Reagens IV: Forint-reagens fortynnet med rent vann i 5 ganger.
Reagens V: Enzymfortynningsmiddel: 0,1M natriumfosfatløsning (pH 8,0).
Reagens VI: tyrosinløsning: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tyrosin oppløst med 0,2M HCl.
Fremgangsmåte
1. 0,5 ml reagens I forvarmes til 37 ℃, tilsett 0,5 ml enzymløsning, bland godt og inkuber ved37 ℃ i 10 minutter.
2. Tilsett 1 ml reagens II for å stoppe reaksjonen, bland godt og fortsett inkubasjonen i 30 minutter.
3. Sentrifuger reaksjonsløsning.
4. Ta 0,5 ml supernatant, tilsett 2,5 ml reagens III, 0,5 ml reagens IV, bland godt og inkuber ved 37 ℃i 30 minutter.
5. OD660ble bestemt som OD1;blank kontrollgruppe: 0,5 ml reagens V brukes til å erstatte enzymløsning for å bestemme OD660som OD2, OD=OD1-OD2.
6. L-tyrosin standardkurve: 0,5 ml forskjellig konsentrasjon L-tyrosinløsning, 2,5 ml reagens III, 0,5 ml reagens IV i 5 ml sentrifugerør, inkuber i 37 ℃ i 30 minutter, påvis for OD660for forskjellig konsentrasjon av L-tyrosin, oppnådde deretter standardkurven Y=kX+b, hvor Y er L-tyrosinkonsentrasjonen, X er OD600.
Beregning
2: Totalt volum reaksjonsløsning (ml)
0,5: Volum enzymløsning (ml)
0,5: Reaksjonsvæskevolum brukt i kromogene bestemmelse (mL)
10: Reaksjonstid (min)
Df: Fortynning multippel
C: Enzymkonsentrasjon (mg/ml)
Referanser
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biofys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Figurer
Fig.1 Optimal pH
100 mM bufferløsning: pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH 9,0-12,5, Glycin-NaOH. Enzymkonsentrasjon: 1mg/ml
Fig.2 Optimal temperatur
Reaksjon i 20 mM K-fosfatbuffer pH 8,0.Enzymkonsentrasjon: 1 mg/ml
Fig. 3 pH Stabilitet
25 ℃, 16 timers behandling med 50 mM bufferløsning: pH 4,5-5,5, Acetat;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, glycin-NaOH.Enzymkonsentrasjon: 1 mg/ml
Fig.4 Termisk stabilitet
30 min behandling med 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8,0.Enzymkonsentrasjon: 1 mg/ml
Fig.5 Oppbevaring stability at 25 ℃
