Superstart qPCR Premix pluss-UNG
Kat.nr.: HCB5071E
Superstart qPCR Premix plus-UNG er en spesialisert reagens designet for realtids PCR kvalitative og kvantitative reaksjoner ved bruk av probebasert deteksjon, utviklet spesielt for frysetørkingsprosesser.Den inneholder et nytt hotstart-enzym Hotstart Taq plus (DG), som har sin Taq-enzymaktivitet forseglet ved romtemperatur, og effektivt hemmer ikke-spesifikk amplifikasjon forårsaket av primer-uspesifikk annealing eller primer-dimerdannelse under lave temperaturforhold, og dermed forbedres spesifisiteten til amplifikasjonsreaksjonen.Denne reagensen bruker en optimalisert qPCR-spesifikk buffer og UNG/dUTP anti-kontamineringssystem for å oppnå rask varmstart, noe som i stor grad forbedrer effektiviteten og følsomheten til qPCR-reaksjoner.Den kan oppnå gode standardkurver i et bredt spekter av kvantifiseringsområder og nøyaktig utføre kvantifisering, og effektivt forhindre falsk positiv amplifikasjon forårsaket av gjenværende PCR-produkter eller aerosolforurensning.Denne reagensen er kompatibel med de fleste fluorescerende kvantitative PCR-instrumenter fra produsenter som Applied Biosystems, Eppendorf, BioRad og Roche etc., og viser god stabilitet i frysetørket form.
Reagenssammensetning
1. 5×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+gratis) (DG)
2. 250 mM MgCl2
3. 4 x lyoprotectant (valgfritt)
Lagringsforhold
Langtidslagring ved -20 ℃;kan lagres ved 4 ℃ i opptil 3 måneder.Bland godt før bruk ogunngå gjentatt frysing og tining.
Sykkelprotokoll
| Fremgangsmåte | Temp. | Tid | Syklus |
| Fordøyelse | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Polymeraseaktivering | 95 ℃ | 1~5 min | 1 |
| Denaturering | 95 ℃ | 10~20 s | 40-50 |
| Gløding og forlengelse | 56~64℃ | 20~60 s | 40-50 |
qPCR væskereaksjon Systamme Forberedelse
|
Komposisjon |
25 µL volum |
50 µL volum |
Endelig konsentrasjon |
| 5×HotstartPremix pluss-UNG(Mg2+gratis) (DG) | 5 µL | 10 µL | 1× |
| 250 mM MgCl2 | 0,45 µL | 0,9 µL | 4,5 mM |
| 4× lyoprotectant1 | 6,25 µL | 12,5 µL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mix2 | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Mal DNA3 | —— | —— | —— |
| ddH2O | Til 25 µL | Til 50 µL | —— |
1. En sluttkonsentrasjon på 0,2μM for primere gir vanligvis gode resultater;når reaksjonsytelsen er dårlig, juster primerkonsentrasjonen innenfor området 0,2-1μM etter behov.Probekonsentrasjonen er vanligvis optimalisert innenfor området 0,1-0,3μM gjennom gradienteksperimenter for å finne optimale kombinasjoner.
2. Kopiantallet av målgener som finnes i forskjellige typer maler varierer;om nødvendig kan gradientfortynning utføres for å bestemme den optimale maltilsetningsmengden.
3. Dette systemet kan lyofiliseres;når kunder bruker dette systemet uten krav til frysetørking, kan 4× lyoprotectant tilsettes selektivt; hvis det kreves frysetørkede produkter, under flytende reagensstadiet produktytelsesvalidering, må det tilsettes 4× lyoprotectant for å sikre konsistens med de lyofiliserte systemkomponentene og effekter.
Når systemet er i brukd for frysetørking, klargjør system as følgende:
| Komposisjon | 25µL Reaksjonssystem |
| 5 ×HotstartPremix pluss-UNG (Mg2+gratis) (DG) | 5 µL |
| 250 mM MgCl2 | 0,45 µL |
| 4× lyoprotectant | 6,25 µL |
| 25×Primer-Probe Mix | 1 µL |
| ddH2O | Til 18~20µL |
* Hvis andre systemer for frysetørking er nødvendig, vennligst kontakt separat.
Lyofiliseringsprosedyress
| Fremgangsmåte | Temp. | Tid | Betingelse | Press |
| Forfrysing | 4℃ | 30 min | Holde |
1 atm |
| -50 ℃ | 60 min | Avkjøling | ||
| -50 ℃ | 180 min | Holde | ||
| Primær tørking | -30 ℃ | 60 min | Oppvarming |
Ultimativt vakuum |
| -30 ℃ | 70 min | Holde | ||
| Sekundær tørking | 25 ℃ | 60 min | Oppvarming |
Ultimativt vakuum |
| 25 ℃ | 300 min | Holde |
2. Ovennevnte lyofiliseringsprosess er kun for referanse.Ulike produkttyper og forskjellige frysetørkere har forskjellige parametere, slik at justeringer kan gjøres i henhold til faktiskeforhold under bruk.
3. Ulike lyofiliseringsprosesser kan være egnet for forskjellige batchstørrelser av lyofiliserteprodukter, så tilstrekkelig testvalidering må utføres når det brukes til storskala produksjon.
Instruksjon for bruk av lyofiliseringd pulver
1. Sentrifuger kort det lyofiliserte pulveret;
2. Tilsett nukleinsyremal til det lyofiliserte pulveret og tilsett vann opptil 25 µL;
3. Bland godt ved sentrifugering og kjør på maskin.
Kvalitetskontroll:
1. Funksjonell testing: sensitivitet, spesifisitet, reproduserbarhet av qPCR.
2. Ingen eksogen nukleaseaktivitet, ingen eksogen endo/eksonukleasekontaminering.
Teknisk informasjon:
1. Superstart qPCR Premix plus-UNG bruker et nytt varmstartenzym som muliggjør rask varmstart innen 1~5 minutter;gjennom spesiell bufferformulering er den egnet for multipleks fluorescerende kvantitative PCR-reaksjoner.
2. Den har høyere spesifisitet som betydelig forbedrer sensitiviteten til fluorescens kvantitativ PCR grense deteksjon, noe som gjør amplifikasjonskurver normalisering, fluorescens verdi oppnå åpenbar forbedring ved lav konsentrasjon maler, egnet som høy sensitivitet fluorescens kvantitative PCR deteksjon reagenser.
3. For primere med lavere annealingstemperatur eller lengre enn 200 bp fragmenter, anbefales 3-trinns metode.
4. Utnyttelseseffektiviteten til dUTP og følsomhet for UNG-enzym er forskjellig for forskjellige målgener, så hvis bruk av UNG-system fører til en reduksjon i deteksjonsfølsomhet, bør reaksjonssystemet justeres og optimaliseres.Hvis teknisk støtte er nødvendig, vennligst kontakt vårt firma.
5. Bruk dedikerte områder og pipetter før og etter amplifikasjon, bruk hansker under drift og skift dem ofte;ikke åpne reaksjonsrøret etter fullført PCR for å minimere kontaminering av prøver med PCR-produkter.
