2×Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
Kat.nr.: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) er designet for å utføre PCR direkte fra prøver uten DNA-ekstraksjon eller prøvepreparering.Dette reagenset består av varmstart DNA-polymerase, uracil-DNA-glykosylase (UNG), RNase-hemmer, MgCl2, dNTP-er (med dUTP i stedet for dTTP), og stabilisatorer, for kvantitativ PCR (qPCR).Denne reagensen har høy inhibitortoleranse, og kan derfor brukes direkte til påvisning av prøver som halspinne, spytt, antikoagulert fullblod, plasma og serum uten DNA-ekstraksjon.Reagensen bruker proprietær buffer for qPCR med blandede enzymer av anti-hemmende DNA-polymerase og UNG-enzym.Derfor kan det oppnå en god amplifisering av målgener i prøver som inneholder inhibitorer og hemme falsk positiv amplifikasjon forårsaket av PCR-rest- og aerosolforurensning.Denne reagensen er kompatibel med de fleste fluorescerende kvantitative PCR-instrumenter, som Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche og så videre.
Komponenter
1. 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix
2. 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP)
Lagringsforhold
Alle komponenter bør oppbevares ved -20 ℃ for langtidslagring og 4 ℃ i opptil 3 måneder.Vennligst bland grundig etter tining og sentrifuger før bruk.Unngå hyppig frysing-tining.
Sykkelprotokoll
| Steg | Temperatur | Tid | Syklus |
| Fordøyelse | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Polymeraseaktivering | 95 ℃ | 1-5 min | 1 |
| Denaturering | 95 ℃ | 10-20 s | 40-50 |
| Gløding/Forlengelse | 56–64 ℃ | 20-60-tallet |
Pipetteringsinstruksjoner
| Reagens | Volum pr reaksjon | Volum per reaksjon | Endelig konsentrasjon |
| 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP) | 12,5 µL | 25 µL | 1× |
| 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix | 0,5 µL | 1 µL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mix1, 2 | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Prøve3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Totalt volum | 25 μL | 50 μL | - |
1. Sluttkonsentrasjonen av primer er vanligvis 0,2μM.For bedre resultater kan primerkonsentrasjonen optimaliseres innenfor området 0,2-1μM.
2. Vanligvis kan probekonsentrasjonen optimaliseres innenfor området 0,1-0,3μM.Den optimale konsentrasjonen av proben er relatert til sanntids-PCR-amplifikasjonsinstrumentet, typen probe og typen fluorescerende merkestoff.Vennligst se instrumenthåndboken eller de spesifikke kravene til hver fluorescerende probe.
3. Ulike typer prøver inneholder ulike typer og innhold av inhibitor og kopinummer av målgen.Prøvevolumet bør vurderes etter faktisk tilstand.Lag en fortynning av prøven ved å tilsette nukleasefritt vann eller TE-buffer, om nødvendig.
4. Anbefalt volum av forskjellige prøver:
| Prøve | Volum for en 50 μL reaksjon | Maksimum forhold |
| Antikoagulert fullblod | 2,5 μL | 5% |
| Plasma | 15 μL | 30 % |
| Serum | 10 μL | 20 % |
| Halsprøve | 10 μL | 20 % |
| Spytt | 10 μL | 20 % |
Kvalitetskontroll
1. Funksjonsdeteksjon: sensitivitet, spesifisitet og repeterbarhet av qPCR.
2. Ingen eksogen nukleaseaktivitet: ingen eksogen endonuklease og eksonukleaseforurensning.
Merknader om produktet
1. Dette produktet bruker en ny type hot-start DNA-polymerase, som kan aktiveres i løpet av 1-5 minutter. Siden reaksjonsbufferen har blitt optimalisert, er den mer egnet for dobbel eller multippel fluorescens kvantitativ PCR ved bruk av probemetoden.
2. Hvis Rn-verdien til PCR-amplifikasjonen er for lav eller amplifikasjonen åpenbart er hemmet, kan reduksjon av prøvemengden, økende reaksjonsvolum eller tidligere fortynning av prøven forbedre resultatene.
3. Innsamling av blod, spytt, urin, svelgpinne osv. bør følge kravene til kliniske kriterier, og fersk prøve kan brukes for å forhindre nedbrytning av nukleinsyre.
4. Siden forskjellige amplikoner har ulik utnyttelseseffektivitet til dUTP og følsomhet for UNG, bør reagensene optimaliseres hvis deteksjonssensitiviteten reduseres ved bruk av UNG-system.Ta kontakt med oss for teknisk støtte ved behov.
5. For å unngå amplifisering av overførte PCR-produkter mellom ett-trinns reaksjoner, kreves dedikert forsøksområde og pipette for amplifikasjon.Bruk hansker og skift ofte og ikke åpne reaksjonsrøret etter PCR-amplifisering.
