Hotstart Taq DNA Polymerase
Hot Start Taq DNA Polymerase (antistoffmodifikasjon) er en varmstart termostabil DNA-polymerase fra Thermus aquaticus YT-1， som har en 5′→3′ polymeraseaktivitet og en 5′ klaff endonukleaseaktivitet.Hot-start Taq DNA polymerase er en Taq DNA polymerase som er modifisert av termolabile Taq antistoffer.Antistoffmodifikasjon økte spesifisitet, sensitivitet og utbytte av PCR.
Komponenter
| Komponent | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq-buffer | 4×1 ml | 4×10 ml | 4×50 ml | 5×400 ml |
| Hot Start Taq DNA-polymerase (antistoffmodifisert) (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 10×5 ml |
applikasjoner
10 mM Tris-HCl (pH 7,4 ved 25 ℃), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, 0,5 % Tween20, 0,5 % IGEPALCA-630 og 50 % glyserol.
Lagringsforhold
Transport under 0°C og lagres ved -25°C~-15°C.
Enhetsdefinisjon
En enhet er definert som mengden enzym som inkorporerer 15 nmol dNTP i syreuløselig materiale på 30 minutter ved 75°C.
Kvalitetskontroll
1.Endonuclease aktivitet:Inkubering av 20 U enzym med 4 μg pUC19 DNA i 4 timer ved 37 ℃ resulterte i ingen detekterbar nedbrytning av DNA som bestemt ved gelelektroforese.
2.5 kb Lambda PCR:25 PCR-amplifikasjonssykluser av 5 ng Lambda-DNA med 1,25 enheter Taq DNA-polymerase i nærvær av 200 µM dNTP-er og 0,2 µM primere resulterer i det forventede 5 kb-produktet.
3.Eksonukleaseaktivitet:Inkubering av en 50 µl reaksjon som inneholder minimum 12,5 U Taq DNA-polymerase med 10 nmol 5´-FAM-oligonukleotid i 30 minutter ved 37 ℃ gir ingen detekterbar nedbrytning.
4.RNase-aktivitet:Inkubering av 10 µL reaksjon inneholdende 20 U enzym med 1 μg RNA-transkript i 2 timer ved 37 °C resulterte i ingen påvisbar nedbrytning av RNA som bestemt ved gelelektroforese.
5.Varmeinaktivering:Nei.
Reaksjonssystem
| Komponenter | Volum |
| Mal DNAa | valgfri |
| 10 μM Fremover Primer | 0,5 μL |
| 10 μM Reverse Primer | 0,5 μL |
| dNTP-miks (10 mM hver) | 0,5 μL |
| 5×HC Taq-buffer | 5 μL |
| Taq DNA-polymeraseb(5U/μL) | 0,125 μL |
| Nukleasefritt vann | Opptil 25 μL |
Merknader:
1) a.
| DNA | Beløp |
| Genomisk | 1 ng-1 μg |
| Plasmid eller viralt | 1 pg-1 ng |
2) b.Den optimale konsentrasjonen av Taq DNA-polymerase kan variere fra 5-50 enheter/ml (0,1-0,5 enheter/25 µL reaksjon) i spesialiserte applikasjoner.
Termisk sykling protokoll
PCR
| Steg | Temperatur(°C) | Tid | Sykluser |
| Innledende denatureringa | 95 ℃ | 1-3 minutter | - |
| Denaturering | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 sykluser |
| Glødingb | 45–68 ℃ | 15-60 s | |
| Utvidelse | 68 ℃ | 1 kb/min | |
| Endelig utvidelse | 68 ℃ | 5 minutter | - |
Merknader:
1) En initial denaturering på 1 min ved 95°C er tilstrekkelig for de fleste amplifikasjoner.For vanskelige maler anbefales en lengre denaturering på 2-3 minutter ved 95°C.Med koloni-PCR anbefales en innledende denaturering på 5 minutter ved 95 °C.
2) Glødetrinnet er typisk 15-60 s.Utglødningstemperatur er basert på Tm til primerparet og er typisk 45-68 ℃.
