Proteinase K NGS (pulver)
Kat.nr.: HC4507A
NGS Protease K er en stabil serinprotease med høy enzymaktivitet og bred substratspesifisitet. Enzymet dekomponerer fortrinnsvis esterbindinger og peptidbindinger ved siden av C-terminalen til hydrofobe aminosyrer, svovelholdige aminosyrer og aromatiske aminosyrer.Så det brukes ofte til å bryte ned proteiner til korte peptider.NGS Protease K er en typisk serinprotease med Asp39-Hans69-Ser224katalytisk triade som er unik for serinproteaser, og det katalytiske senteret er omgitt av tau Ca2+bindingssteder for stabilisering, opprettholde høy enzymaktivitet under et bredere spekter av forhold.
Spesifikasjon
| Utseende | Hvitt til off-white amorft pulver, lyofilisert |
| Spesifikk aktivitet | ≥40U/mg fast stoff |
| DNase | Ingen oppdaget |
| RNase | Ingen oppdaget |
| Biobelastning | ≤50CFU/g fast stoff |
| Nukleinsyrerest | <5 pg/mg fast |
Egenskaper
| Kilde | Tritirachium album |
| EC-nummer | 3.4.21.64(Rekombinant fra Tritirachium album) |
| Molekylær vekt | 29 kDa (SDS-SIDE) |
| Isoelektrisk punkt | 7.81 Fig.1 |
| Optimal pH | 7.0-12.0 (Alle utfører høy aktivitet) Fig.2 |
| Optimal temperatur | 65℃ Fig.3 |
| pH-stabilitet | pH 4,5-12,5 (25℃,16t) Fig.4 |
| Termisk stabilitet | Under 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Fig.5 |
| Lagringsstabilitet | Lagret ved 25 ℃ i 12 måneder Fig.6 |
| Aktivatorer | SDS, urea |
| Inhibitorer | diisopropylfluorfosfat;benzylsulfonylfluorid |
Lagringsforhold
Oppbevar det lyofiliserte pulveret ved -25~-15 ℃ i lang tid vekk fra lys;Etter oppløsning, alikvoter i passende volum for korttidslagring ved 2-8 ℃ vekk fra lys eller langtidslagring ved -25~-15 ℃ vekk fra lys.
Forholdsregler
Bruk vernehansker og vernebriller ved bruk eller veiing, og hold godt ventilert etter bruk.Dette produktet kan forårsake hudallergiske reaksjoner og alvorlig øyeirritasjon.Ved innånding kan det forårsake allergi- eller astmasymptomer eller dyspné.Kan forårsake irritasjon i luftveiene.
Enhetsdefinisjon
En enhet NGS Protease K er definert som mengden enzym som kreves for å hydrolysere kasein til 1 μmol L-tyrosin under standard bestemmelsesbetingelser.
Klargjøring av reagenser
| Reagens | Produsent | Katalog |
| Kasein tekniskfra storfemelk | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Trikloreddiksyre | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Natriumacetat | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Eddiksyre | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Natriumkarbonat | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Folin-fenol | Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tyrosin | Sigma | 93829 |
Reagens I:
Substrat: 1 % kasein fra bovin melkeløsning: løs 1 g bovin melk kasein i 50 ml 0,1 M natriumfosfatløsning, pH 8,0, varm opp i vannbad ved 65-70 °C i 15 minutter, rør og løs opp, avkjøl med vann, justert med natriumhydroksid til pH 8,0, og fortynn til 100 ml.
Reagens II:
TCA-løsning: 0,1M trikloreddiksyre, 0,2M natriumacetat og 0,3M eddiksyre (vei opp 1,64g trikloreddiksyre + 1,64g natriumacetat + 1,724mL eddiksyre suksessivt, tilsett 50mL avionisert vann, juster med HCl til pH 4,03 100 ml).
Reagens III:
0,4 m natriumkarbonatløsning (vei 4,24 g vannfritt natriumkarbonat og løs opp i 100 ml vann)
Reagens IV:
Folinfenolreagens: Fortynn 5 ganger med avionisert vann.
Reagens V:
Enzymfortynningsmiddel: 0,1 M natriumfosfatløsning, pH 8,0.
Reagens VI:
L-tyrosin standardløsning: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tyrosin oppløst med 0,2 M HCl.
Fremgangsmåte
1. Slå på UV-Vis spektrofotometer og velg fotometrisk måling.
2. Still inn bølgelengden til 660nm.
3. Slå på vannbadet, still temperaturen til 37 ℃, sørg for at temperaturen er uendret i 3-5 minutter.
4. Forvarm 0,5 ml substrat i et 2 ml sentrifugerør ved 37 ℃ vannbad i 10 minutter.
5. Trekk ut 0,5 ml fortynnet enzymløsning i det forvarmede sentrifugerøret i 10 minutter.Sett enzymfortynningsmiddel som blank gruppe.
6. Tilsett 1,0 mL TCA-reagens umiddelbart etter reaksjonen.Bland godt og inkuber i vannbad i 30 minutter.
7. Sentrifuger reaksjonsløsning.
8. Legg til følgende komponenter i den angitte rekkefølgen.
| Reagens | Volum |
| Supernatant | 0,5 ml |
| 0,4M natriumkarbonat | 2,5 ml |
| Folin fenol reagens | 0,5 ml |
9. Bland godt før inkubering i vannbad ved 37 ℃ i 30 minutter.
10. OD660ble bestemt som OD1;blank kontrollgruppe: Enzymfortynningsmiddel brukes til å erstatte enzymløsning for å bestemme OD660som OD2, OD=OD1-OD2.
11. L-tyrosin standardkurve: 0,5 ml forskjellig konsentrasjon L-tyrosinløsning, 2,5 ml 0,4M natriumkarbonat, 0,5 ml folinfenolreagens i 5 ml sentrifugerør, inkuber i 37 ℃ i 30 minutter, påvis for OD660for forskjellig konsentrasjon av L-tyrosin, oppnådde deretter standardkurven Y=kX+b, hvor Y er L-tyrosinkonsentrasjonen, X er OD600.
Beregning
2: Totalt volum reaksjonsløsning (ml)
0,5: Volum enzymløsning (ml)
0,5: Reaksjonsvæskevolum brukt i kromogene bestemmelse (mL)
10: Reaksjonstid (min)
Df: Fortynning multippel
C: Enzymkonsentrasjon (mg/ml)
Figurer
Fig. 1 DNA-rest
| Prøve | Ave C4 | Nukleinsyre Gjenoppretting (pg/mg) | Gjenoppretting(%) | Total Nucleic Syre ( pg/mg) |
| PRK | 24,66 | 2.23 | 83 % | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| RNA-fri H2O | Ubestemt | — | — | — |
Fig.2 Optimal pH
Fig.3 Optimal temperatur
Fig.4 pH-stabilitet
Fig.5 Termisk stabilitet
Fig.6 Lagringsstabilitet ved 25℃
